原代細胞培養(yǎng)的應(yīng)用

1、為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段;

2、為傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件;

3、服務(wù)于臨床實踐，用于藥物篩選等。

原代細胞培養(yǎng)之取材

取材作為原代細胞培養(yǎng)過程中的第一部至關(guān)重要，以下幾種取材技術(shù)，你都用過哪些方法呢？

各類組織取材，操作及注意事項：

1.皮膚和粘膜

主要取皮片，面積一般2~4平方厘米。

2.內(nèi)臟和實體瘤

（1）無菌環(huán)境；

（2）熟悉所需組織的類型和部位；

（3）要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締組織。

3.血液細胞

一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中(如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等)分離細胞，取材時應(yīng)注意抗凝。

4.骨髓、羊水、胸/腹水細胞

嚴(yán)格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。

5.動物組織取材——鼠胚組織

（1）用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物；

（2）將其浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后取出動物；

（3）在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚；

（4）用無菌操作法解剖取胚。

6.動物組織取材——幼鼠胚腎(或肺)

幼鼠采用上述方法處死消毒后→腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開至兩側(cè)→采用無菌法打開胸腔取肺，或從背部打開腹腔取腎。

7.雞(鴨)鳥類胚胎組織

（1）取孵化至適當(dāng)胚齡(9~12天)的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋，說明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置；

（2）將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干;經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼;

（3）用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚;

（4）用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。

   小鼠小膠質(zhì)細胞

大鼠血管平滑肌細胞

原代細胞培養(yǎng)之分離注意事項

1.組織塊培養(yǎng)法

（1）組織塊接種后的前3天，在觀察和移動的過程中，注意不要引起液體的振蕩。要避免經(jīng)常翻動和振動，否則組織塊不易附著于瓶壁上或附著后也會脫落飄起。

（2）加入的培養(yǎng)液不宜過多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動而脫落下來。

（3）當(dāng)細胞向外遷徙出來后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細胞，它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會影響原代細胞的生長。

（4）為促進組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上，可以在種植前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。

2.貼壁型原代細胞

（1)原代培養(yǎng)的分離細胞在初次接觸體外環(huán)境時，它們之間會互相影響，在這些細胞之間能產(chǎn)生一些促生長的活性物質(zhì)，使細胞彼此互相促進存活和生長。如果接種的細胞密度過低，細胞之間的促生長作用很小，也很難使細胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進入獨立生存環(huán)境的變化過程。如果接種的細胞密度過大，會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，代謝廢物積累較快需要經(jīng)常換液和傳代。

（2）適當(dāng)增大原代培養(yǎng)接種的細胞密度，給培養(yǎng)的細胞提供更多的類似于在體內(nèi)時細胞之間的相互作用，會極大提高原代培養(yǎng)的細胞在體外存活率。待細胞適應(yīng)體外環(huán)境后進行傳代培養(yǎng)時再以較低的密度接種和培養(yǎng)。

（3）盡快使接種的細胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵?？梢栽诮臃N后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h，待細胞貼壁后，再補足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

3.懸浮型原代細胞

（1）必須保持細胞的懸浮狀態(tài)?？梢酝ㄟ^增加培養(yǎng)液的黏度來幫助細胞呈懸浮狀態(tài)，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液是，以5ml為限度，否則攪拌時會產(chǎn)生氣泡對細胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過快，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細胞換液時要注意不要吸出細胞。

（2）能夠進行懸浮培養(yǎng)的細胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營養(yǎng)成分消耗大，換液時間隔一般較短。